论文推荐｜Box-Behnken响应面法优化超声提取皱皮木瓜总黄酮工艺

作者：刘岩、吕宗凯、刘连芬、钱关泽。

单位：聊城大学生命科学学院。

简介：刘岩，女性，来自河北唐山，拥有硕士研究生学历。她的研究方向是植物学，并且是*通信作者。刘岩教授是一位博士、硕士生导师，专注于种子植物的分类和资源利用研究。

基金项目：国家自然科学基金项目(31070619,31170178)和山东省自然科学基金项目(ZR2011CM045)。

来源：《安徽农业科学》2023年第10期。

刘岩、吕宗凯、刘连芬等.通过Box-Behnken响应面法优化超声提取皱皮木瓜总黄酮工艺[J].安徽农业科学,2023,51(10):144-148.长按识别。

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皱皮木瓜，又称楙、贴梗木瓜、贴梗海棠、铁脚梨等，属于蔷薇科木瓜属植物。它在安徽、浙江、陕西、甘肃、广东、云贵川及缅甸等地均有分布。皱皮木瓜是一种常见的栽培及药用植物，其花色有乳白色、粉红色、大红色，且有重瓣及半重瓣品种。早春时，皱皮木瓜的花朵先于叶子开放。皱皮木瓜含有丰富的有机酸、三萜类、黄酮类化合物、熊果酸、多糖及超氧化物歧化酶(SOD)等成分，被誉为“百益之果”。皱皮木瓜是一种药食同源的植物，其药理学研究表明，这些物质具有抗癌、抑制肿瘤、抗炎杀菌、抗氧化等功效。

目前，皱皮木瓜的研究主要集中在其栽培技术和药用价值上。对其活性物质的研究主要集中在皂苷、熊果酸、齐墩果酸和有机酸等方面。虽然有少量学者报道了皱皮木瓜中黄酮类物质的提纯方法和总黄酮含量，但由于皱皮木瓜分布区的差异，其含有的总黄酮含量并不完全相同。目前，关于木瓜中黄酮类物质的提取工艺优化研究报道甚少。黄酮类化合物的传统提取方法主要包括水提法、溶剂萃取法、树脂吸附法等。近年来，国内外新开发了超声辅助提取法、超临界流体萃取法、微波萃取法和酶提取法等提取方法，其中超声辅助提取法具有快速、低成本、高提取率、无试剂残留污染环境等优点。它可以与其他提取方式结合使用，是一种具有极大发展前景的物质提取方式。

目的：

发掘皱皮木瓜叶片的利用价值，减少枯枝败叶对环境的污染和压力。

采用...方法。

本文以皱皮木瓜为蔷薇科植物，以叶片为试验材料，通过单因素试验探究总黄酮提取的最适范围。通过响应面法(RSM)和Box-Behnken试验设计结合二次回流优化超声辅助提取总黄酮工艺，获得了最佳提取方案。

结果：

◆建立芦丁标准曲线。

以吸光度为纵坐标(y)，芦丁质量浓度(mg/mL)为横坐标(x)，建立芦丁标准曲线(图1)。通过回归方程y=1.445x-0.0176(R2=0.9999)，可以得出芦丁在0~1.5mg/mL之间表现出良好的线性关系。

图1显示了芦丁标准曲线的绘制方法。

『单因素试验』。

乙醇浓度对总黄酮提取率的影响如图2所示。在提取温度、提取时间、料液比固定的情况下，乙醇浓度在50%～70%之间，总黄酮提取率呈上升趋势。当乙醇浓度达到70%时，总黄酮提取率达到最大值(15.16%)。然而，当乙醇浓度超过70%时，总黄酮提取率显著下降，到90%时总黄酮提取率为13.73%，比最大值下降了9.43%。这表明，在70%的乙醇中，皱皮木瓜的总黄酮溶解度最大，因此我们选择70%作为皱皮木瓜叶片总黄酮提取的乙醇浓度。

图2显示了乙醇浓度对总黄酮提取率的影响。

图3显示了料液比对总黄酮提取率的影响。在一定的提取温度、提取时间和乙醇浓度下，总黄酮提取率随着料液比的减少而先上升后下降。当料液比为1∶30时，总黄酮提取率为13.02%;当料液比为1∶40时，总黄酮提取率为14.29%，增长了9.75%。因此，选择1∶40作为皱皮木瓜叶片总黄酮提取的料液比。

图3显示了料液比对总黄酮提取率的影响。

图4显示了提取时间对总黄酮提取率的影响。在一定的提取温度、乙醇浓度和料液比下，提取时间在20~50分钟之间，总黄酮提取率先缓慢上升后急剧上升。在提取时间达到50分钟时，总黄酮提取率达到最高值，为15.55%。随着时间的增加，总黄酮提取率急剧下降，在60分钟时仅为14.09%。这表明，随着提取时间的增加，总黄酮提取率是提高的，但超过一定限值后会急剧下降。因此，在工业生产中，选择50分钟作为皱皮木瓜叶片总黄酮提取时间，可以达到节约时间和经济成本的目的。

编辑:图4显示了提取时间对总黄酮提取率的影响。

编辑:图5显示了提取温度对总黄酮提取率的影响。随着提取温度的增加，总黄酮提取率逐渐增加，在40°C时达到峰值，为16.01%。当提取温度超过40°C时，总黄酮提取率急剧下降。结果表明，随着提取温度的增加，总黄酮提取率会提高。但是，当温度超过一定限值时，总黄酮提取率会下降。这可能是由于温度过高导致部分黄酮类化合物结构遭到破坏，或是因为溶剂挥发损失导致总黄酮提取率降低。因此，我们选择40°C作为皱皮木瓜叶片总黄酮提取的温度。

编辑:图5显示了提取温度对总黄酮提取率的影响。

『响应面试验』。

根据单因素试验结果，我们对影响皱皮木瓜叶片总黄酮提取率的不同因素(料液比、提取时间、乙醇浓度)进行了Box-Behnken试验设计。表1展示了不同因素及水平组合条件下皱皮木瓜叶片总黄酮提取率。结果表明，在提取时间50min、乙醇浓度70%、料液比1∶40时，皱皮木瓜叶片总黄酮提取率最高，为15.77%。

使用DesignExpert8.05软件对表1数据进行统计分析，发现料液比(A)、提取时间(B)和乙醇浓度(C)这3个因素与皱皮木瓜叶片总黄酮提取率(Y)之间存在二次回归方程：Y=15.74+0.036A+0.059B+0.045C-0.010AB+0.018AC-0.012BC-0.220A2-0.130B2-0.060C2(R2=0.9994)。方差分析结果显示，模型显著且失拟项不显著，说明试验误差较小，具有统计学意义;决定系数(R2)大于0.9，说明模型具有较高的拟合度，可用于优化皱皮木瓜叶片总黄酮提取条件。

表2中回归模型的显著性检验结果表明，料液比(A)不显著(P>0.05)，而提取时间(B)和乙醇浓度(C)均显著(P<0.05)。这表明，在皱皮木瓜叶片总黄酮提取率方面，料液比的影响并不显著，而提取时间和乙醇浓度的影响较为显著。此外，A2和B2表现为极显著(P<0.01)，而C2则表现为显著(P<0.05)。这表明，乙醇浓度、料液比和提取时间对皱皮木瓜叶片总黄酮提取率的影响是较为复杂的二次关系，且影响顺序为提取时间>乙醇浓度>料液比。

◆对皱皮木瓜叶片总黄酮提取率响应面多因素交互作用分析

根据图6至图8，在一定的料液比、提取时间和乙醇浓度条件下，总黄酮提取率随着第3个因素的增大而先上升后下降。料液比和提取时间的等高线形状偏圆，表明两者交互作用较缓和。乙醇浓度与料液比的等高线呈椭圆形，表明两者交互作用显著。乙醇浓度和提取时间的等高线呈椭圆形，表明两者交互作用也显著。从响应面的3D图中可以看出，料液比和提取时间、料液比和乙醇浓度、乙醇浓度和提取时间的三条曲线均较陡，说明两者的交互作用对总黄酮提取率的影响较大。

图6显示了料液比与提取时间对木瓜叶片总黄酮提取率交互影响的等高线和响应面。

图7显示了料液比与乙醇浓度对木瓜叶片总黄酮提取率的影响，以及它们之间的交互作用。

图8显示了乙醇浓度与提取时间对木瓜叶片总黄酮提取率的影响，以及它们之间的交互作用。

确定总黄酮的最佳提取参数并进行验证性试验。

通过分析回归方程，我们选择了Maximize模式来优化总黄酮提取工艺。经过优化后，最优提取条件为：提取时间52分钟、乙醇浓度73.64%、料液比1∶40.94。此时，皱皮木瓜叶片的总黄酮提取率理论值为15.75%。

为了验证回归方程，我们进行了皱皮木瓜叶片总黄酮提取率验证试验。试验采用提取时间52min、乙醇浓度74%、料液比1∶41的条件进行3组平行试验，回流提取2次。结果显示，总黄酮提取率实际均值为15.67%，RSD小于5%，与理论值基本一致。这说明Box-Behnken响应面优化设计得到的各因素水平条件组合比较可靠，可以用于实际操作以及优化提取参数。

结论：

该研究结果显著提高了皱皮木瓜叶片总黄酮的得率，并证明了使用响应面法优化提取皱皮木瓜叶片总黄酮工艺的可行性。这充分挖掘了木瓜的潜在利用价值，在控制成本、提高效率、保护环境、减少污染方面具有巨大优势。因此，皱皮木瓜原料得到了更为高效的利用，为扩大皱皮木瓜工业生产及产品的开发利用提供了可靠依据。

采编：夏梦 排版：小同。